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MPN法的重要提示

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1.樣品均質和係列稀釋必須保證均勻

MPN法樣品均質和稀釋液混勻非常重要。MPN法的兩點假設之一是“微生物在完全混勻的稀釋液裏隨機分布”。混勻不充分,就滿足不了MPN法統計的基礎,從而不能獲得準確的結果。

 

2.試管各稀釋度接種完全

通常,實驗室按照3管接種係統來進行MPN檢測,即每個稀釋度接種3管。然而,往往由於樣品中細菌數量比較低,陽性管數很少,很多檢測人員為圖省事僅接種前2個稀釋度。這種做法是十分錯誤的,僅按照前兩個稀釋度的結果是沒法獲得MPN結果的。3個稀釋度中,低的稀釋度並不一定比高的稀釋度陽性管數多。不管前2個稀釋度的結果如何, 一個稀釋度的結果都是沒法預測的。因此,在實際工作中,即便預先估計樣品中細菌濃度很低, 9支試管也必須全部接種。

 

另外,要盡可能多接種幾個稀釋度,杜絕出現全部稀釋度都為陽性的情況,最好能保證結果中包含全陽性或全陰性的稀釋度。

 

3.對接種量和培養基量需要正確理解

接種量是MPN法成功與否的關鍵,一方麵接種量要適當以便於出現全陽性和全陰性的稀釋度,另一方麵接種量必須準確。MPN表和MPN計算公式都是和接種量密切相關的。而培養基的體積是多少並不重要,隻要接種後培養基濃度接近正常濃度(單倍濃度)就可以了。通常接種稀釋液的體積是1 mL,這個體積必須準確,而培養基的量是10 mL還是9mL都無所謂。常有人將MPN接種與平板計數稀釋混淆,以為必需1 mL稀釋液接種到9 mL培養基中。

 

4.確證後的試管才能計做陽性管

有的MPN法需要多步才能完成可疑菌的確證。隻有最終確定為陽性的管才能計數為陽性管。如果沒有完成確證步驟,把中間步驟的陽性管計做陽性,就會獲得偏高的檢測結果。

 

5.正確理解MPN計數的檢測限和精密度

MPN表中最低結果通常表示為“<3/g( mL)"或“<30/100 g(mL)",因此很多檢測人員認為MPN法的最高檢測限隻能達到“3/g(mL)"或“30/ 100 g(mL)"

 

隻要調整接種的樣品量, MPN法可以檢測任何濃度的樣品。例如, 3管法按等體積接種雙料肉湯,就能將固體樣品的檢測限提高到“0.3/g"。但是, MPN法是根據概率估計去推算結果,與平板計數直接計數法比起來結果的精密度要差一些。因此,實際工作中MPN法常用於汙染水平低的樣品的檢測,汙染水平低的樣品靠平板計數等直接計數方法是不易檢測的,尤其是對於固體樣品汙染水平低於10 CFU/g時。



調整接種的樣品量還可以采取提高每個稀釋度的管數的方法,還能提高MPN法的精密度,獲得和平板計數相當(每個稀釋度接種10)甚至更高的精密度(每個稀釋度接種10管以上).由於增加每個稀釋度的管數導致工作量急劇增加,因此這種做法一般都采用單稀釋度接種係統,用來檢測低濃度的樣品。

 

6.陽性管數組合檢索不到的情況處理

有的檢測人員檢索MPN表時發現,有的陽性管數組合檢索不到,例如,"0-0-3",遇到這種情況不知該如何處理。

 

在以前的MPN法檢測標準裏, MPN表中包含所有的陽性管數組合(3管法包括4x4 x4=64),甚至包括“0-0-3"這樣幾乎不可能出現的組合。事實上,我們應該對這種結果持高度懷疑態度,應棄用這種結果,重新檢測。因此,在新的MPN法檢測標準裏去掉了這些幾乎不可能出現的組合。例如, GB 4789.3-2016 《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 大腸菌群計數》僅包括40組陽性管數組合。

 

7. MPN值需要正確理解

MPN值是基於統計的估計結果, MPN值是可能性最大的一個估計值,其95%置信區間有95%的可能包括真實結果。結果報告的MPN值要結合95%置信限來理解, MPN結果實際上是一個結果分布。

 

以下麵一個例子來理解MPN結果。

【例4-3 GB 4789.3-2016 中表B. 1接種量0. 1 g0.01 g0.001 g對應的陽性管數2 20。產品限量是“<20 MPN/g"。此產品合不合格?

 

查表得MPN值為“21 MPN/g",其上、下95%置信限分別為“42 MPN/g"和“4.5 MPN/g"。即每克樣品中21個大腸菌群,有95%的可能結果分布在每克4.5 (下限)個至42(上限)之間。換句話說,接種量0.1g0.01 g 0.001 g對應的陽性管數220100次檢測中,有95個結果在每克4.5個至42個之間,其中每克21個的結果次數最多。

 

繪製圖4-9幫助理解。



 

MPN結果是圖4-9中的曲線(以鍾形曲線表示),最可能的結果是"4.5"和“42"之間的可能性占95%。平板計數的結果“20"。可以看出,由一半稍多的MPN結果是高於平板計數結果的,另外的MPN結果是低於平板計數結果的。因此,無法判斷

MPN報告的結果是否高於平板計數的結果。

 

8.MPN計數結果與平板計數結果孰高孰低

與平板計數法相比,有人說MPN計數偏高,也有人說MPN計數偏低。其實兩者的高低並不是絕對的,而是與所用的培養基選擇性密切相關。當MPN法的培養基選擇性差,更多的非目標菌會被誤當作陽性結果,計數容易偏高;當MPN法的培養基選擇性高,低濃度的目標菌生長不起來,計數就容易偏低。